PCR污染源中的處理方法
發(fā)布時間：2013-08-13 閱讀：725次
PCR反應(yīng)污染的處理方法
一、環(huán)境污染源處理：
(1)稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤。
(2)紫外照射法： 254/300nm波長紫外線照射30分鐘。適用于500bp以上長片段核酸。
二、反應(yīng)液污染源處理：
(1)DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I,室溫反應(yīng)30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染DNA的序列。
(2)內(nèi)切酶法：選擇識別4個堿基的內(nèi)切酶（如Msp I和Taq I等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進(jìn)行PCR。
(3)紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射，適用于500bp以上長片段核酸。
三、尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴(kuò)增片段通常為300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。
(1)原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT.這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。
(2)dUTP法：用dUTP代替dTTP,使產(chǎn)物中摻入大量dU.在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。
(3)dU引物法：合成引物時以dU 代dT,這樣PCR產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU.UNG處理后，引物失去了結(jié)合位點而不能擴(kuò)增。對長片段（1-2kb以上）的擴(kuò)增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點。dU引物將dU設(shè)計在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。
(4)優(yōu)點：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴(kuò)增在同一個反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。
(5)需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會被受體菌UNG消化掉。
四、固相捕獲法
用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：
(1）用一生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)。
(2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)
(3）洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA探針雜交區(qū)域。第(2)步的漂洗后可用PCR檢測以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。
五、RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端(A區(qū))有2 0個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0個核苷酸(C區(qū))為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使 cDNA與多余引物分開，再用和第二引物(C)以鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA,以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物C進(jìn)行擴(kuò)增加尾cDNA,而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才不會被擴(kuò)增。
六、抗污染引物法
該對引物擴(kuò)增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個區(qū)域與克隆位點被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本，也不能擴(kuò)增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。
一、環(huán)境污染源處理：
(1)稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤。
(2)紫外照射法： 254/300nm波長紫外線照射30分鐘。適用于500bp以上長片段核酸。
二、反應(yīng)液污染源處理：
(1)DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I,室溫反應(yīng)30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點是不需要知道污染DNA的序列。
(2)內(nèi)切酶法：選擇識別4個堿基的內(nèi)切酶（如Msp I和Taq I等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進(jìn)行PCR。
(3)紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射，適用于500bp以上長片段核酸。
三、尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴(kuò)增片段通常為300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。
(1)原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT.這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。
(2)dUTP法：用dUTP代替dTTP,使產(chǎn)物中摻入大量dU.在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。
(3)dU引物法：合成引物時以dU 代dT,這樣PCR產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU.UNG處理后，引物失去了結(jié)合位點而不能擴(kuò)增。對長片段（1-2kb以上）的擴(kuò)增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點。dU引物將dU設(shè)計在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。
(4)優(yōu)點：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴(kuò)增在同一個反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。
(5)需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會被受體菌UNG消化掉。
四、固相捕獲法
用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：
(1）用一生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)。
(2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)
(3）洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA探針雜交區(qū)域。第(2)步的漂洗后可用PCR檢測以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。
五、RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端(A區(qū))有2 0個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0個核苷酸(C區(qū))為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使 cDNA與多余引物分開，再用和第二引物(C)以鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA,以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物C進(jìn)行擴(kuò)增加尾cDNA,而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才不會被擴(kuò)增。
六、抗污染引物法
該對引物擴(kuò)增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個區(qū)域與克隆位點被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本，也不能擴(kuò)增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。
